新型冠狀病毒的檢測(cè)在過(guò)去一段時(shí)間內(nèi)成為了被大家所關(guān)心的話題。一方面,早在1月上旬,科學(xué)家們對(duì)新型冠狀病毒完成測(cè)序之后就有好幾家企業(yè)加班加點(diǎn)兩三天內(nèi)完成了“核酸檢測(cè)試劑盒”,并且產(chǎn)能看起來(lái)頗為足夠。但另一方面,即使中旬后放開(kāi)了檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),不需要通過(guò)國(guó)家疾控中心才能確診,仍然有大量患者無(wú)法得到確診。這其中的檢測(cè)卡口以及使用試劑盒檢測(cè)的難點(diǎn)到底在哪呢?
乍聽(tīng)起來(lái),試劑盒好像是類似于化學(xué)課上酸堿試紙那樣的東西,滴一滴就會(huì)變色??蓪?shí)際上它的用法與最初的想象大不相同,復(fù)雜多了。
確診由病毒引起的疾病有幾種方式。從大類上分,可以直接檢測(cè)病毒的核酸,或者檢測(cè)病毒中會(huì)讓人產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原,或是檢測(cè)人體免疫反應(yīng)所產(chǎn)生的抗體。由于科學(xué)家迅速對(duì)病毒完成了測(cè)序,因此這次最早完成設(shè)計(jì)生產(chǎn)的試劑盒也是屬于檢測(cè)核酸的類別。它使用的方法叫做PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)),能夠快速對(duì)微量DNA進(jìn)行檢測(cè),并且相當(dāng)靈敏。除了生物領(lǐng)域以外,它在法醫(yī)和考古等領(lǐng)域也有著重要的應(yīng)用。
檢測(cè)冠狀病毒的時(shí)候會(huì)采取病人的鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等作為樣本——換言之就是可能包含有病毒的東西。之后,需要用試劑提取出其中的核酸部分。由于冠狀病毒的遺傳物質(zhì)是單鏈的RNA,因此還需要使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA。
回顧一下中學(xué)生物有關(guān)DNA的內(nèi)容:DNA是生物體內(nèi)記錄信息的物質(zhì),呈雙鏈結(jié)構(gòu)。每條鏈都由一系列核苷酸組成。每個(gè)核苷酸會(huì)攜帶四種堿基之一:A,T,C和G。兩條鏈之間按A-T和C-G的堿基互補(bǔ)規(guī)則匹配。
檢測(cè)病毒時(shí),樣本內(nèi)不只有病毒的核酸,還有人體細(xì)胞以及其他各種正常存在的細(xì)菌、病毒的核酸。打個(gè)比方的話,就好像是要求從一個(gè)雜亂無(wú)章的圖書(shū)倉(cāng)庫(kù)里找出有沒(méi)有西游記一樣。PCR的想法就是對(duì)需要的DNA片段進(jìn)行復(fù)制。如果有一種專門(mén)負(fù)責(zé)抄寫(xiě)西游記的小妖怪,一本抄兩本,兩本抄四本,那只要倉(cāng)庫(kù)里有一本西游記,很快就能讓倉(cāng)庫(kù)里出現(xiàn)大量的西游記,到時(shí)候再檢測(cè)就容易多了。
這種小妖怪聽(tīng)起來(lái)很神奇,實(shí)際上模擬的正是我們體內(nèi)每天都在進(jìn)行的DNA復(fù)制。PCR首先會(huì)用高溫讓DNA變成單鏈,然后利用兩種物質(zhì)進(jìn)行DNA復(fù)制過(guò)程:一種叫“引物”,是一小串核苷酸鏈,能自動(dòng)結(jié)合到能夠匹配的DNA片段上??梢园阉胂癯梢粋€(gè)神奇書(shū)簽。預(yù)先往書(shū)簽上寫(xiě)好幾個(gè)字,它就可以自動(dòng)找出倉(cāng)庫(kù)里寫(xiě)有這幾個(gè)字的書(shū)頁(yè)粘上去。另一種叫“聚合酶”,會(huì)從引物開(kāi)始,為單鏈DNA補(bǔ)齊另外一條。它相當(dāng)于一個(gè)抄書(shū)匠,會(huì)從神奇書(shū)簽開(kāi)始抄書(shū)。這樣就產(chǎn)生了“擴(kuò)增”“特定”DNA片段的效果。設(shè)計(jì)病毒的核酸檢測(cè)試劑盒的過(guò)程主要是根據(jù)病毒的測(cè)序結(jié)果選擇其中的幾個(gè)有特征的基因,并在每個(gè)基因靠近頭尾的地方選取兩串引物。為了保證實(shí)驗(yàn)效果,對(duì)引物還有一些額外的要求,比如活性溫度必須適當(dāng),引物之間不能結(jié)合等等。
除了復(fù)制以外,還需要檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程是否順利。目前的試劑盒采用的是熒光探針?lè)ā晒馓结樖菐в袃蓚€(gè)額外基團(tuán)的小串核苷酸鏈,其中一個(gè)能放出熒光。但是,探針完整時(shí)熒光會(huì)被另一個(gè)基團(tuán)吸收。在DNA復(fù)制過(guò)程中,聚合酶會(huì)將熒光探針?lè)纸猓a(chǎn)生熒光。這就像是一個(gè)有著熒光膜的神奇書(shū)簽。抄書(shū)匠在抄書(shū)過(guò)程中一旦發(fā)現(xiàn)就會(huì)撕掉。DNA每擴(kuò)增一次理論上就會(huì)多一倍熒光分子,這樣就可以根據(jù)熒光的強(qiáng)度看出DNA擴(kuò)增的次數(shù)。如果原始樣品里有目標(biāo)片段,熒光的強(qiáng)度就會(huì)隨著擴(kuò)增次數(shù)指數(shù)增長(zhǎng)。如果沒(méi)有目標(biāo)片段,就不會(huì)產(chǎn)生新的熒光分子。
這整套測(cè)試過(guò)程需要實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)來(lái)完成,它有著溫度控制和實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的功能。分解DNA成單鏈、引物結(jié)合和聚合酶工作的反應(yīng)溫度均不相同,儀器需要以固定的時(shí)間間隔在兩個(gè)溫度間循環(huán)(后兩者所需溫度差不超過(guò)3攝氏度時(shí)可以用一個(gè)溫度)。檢測(cè)熒光強(qiáng)度則需要包含光源和探測(cè)器的裝置。光源能夠精密地照射到每一個(gè)樣品上,然后由探測(cè)器檢測(cè)熒光的強(qiáng)度。隨著擴(kuò)增循環(huán),熒光強(qiáng)度就會(huì)畫(huà)出一條曲線,用以判斷目標(biāo)DNA片段是否存在。按照目前新聞的報(bào)道,PCR每批測(cè)試時(shí)間需要2-4個(gè)小時(shí),普通PCR儀一次可以對(duì)96個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)試,高級(jí)的PCR儀可以一次做384個(gè)樣本,武漢市內(nèi)十個(gè)實(shí)驗(yàn)室每天總共可以檢測(cè)2000多例。(到文章發(fā)布為止,湖北省內(nèi)據(jù)說(shuō)每天可以檢測(cè)4000多例)
除此之外,由于PCR技術(shù)異常靈敏,因此需要專門(mén)的實(shí)驗(yàn)室和人員進(jìn)行操作。在基本的實(shí)驗(yàn)室布置中,儲(chǔ)藏試劑、準(zhǔn)備樣品和進(jìn)行PCR需要在三個(gè)不同的房間進(jìn)行,并且還需要PCR室保持負(fù)壓潔凈狀態(tài),即PCR室的空氣不會(huì)流入其他房間,這樣才可以保證樣品不會(huì)受到擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物污染。而如果針對(duì)病毒處理的話,還要求實(shí)驗(yàn)室需要具備相應(yīng)的病毒防護(hù)資質(zhì)才可以(當(dāng)然不需要P4級(jí)別那么高)。整套下來(lái)并非所有醫(yī)院都能輕松配備。
而針對(duì)病人,一個(gè)病人在病程中可能需要經(jīng)歷至少三次測(cè)試:一次確診(結(jié)果陽(yáng)性,視病程不同也可能因?yàn)榧訇幮远貜?fù)幾次)與判斷治愈需要的兩次測(cè)試(要求結(jié)果陰性),而目前每天新增的疑似病人也超過(guò)了湖北省內(nèi)的處理能力。所以雖然生產(chǎn)試劑盒的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于疑似人數(shù),但實(shí)際做測(cè)試的數(shù)目還是非常有限的。
PS:抗原試劑需要在GMP凈化車間進(jìn)行灌裝封口、全自動(dòng)灌裝無(wú)人工接觸才符合生產(chǎn)要求,避免二次污染
PS:廣東冠鴻智能的試劑灌裝機(jī)精度高、產(chǎn)量穩(wěn)定15000支/小時(shí) 值得推薦