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關(guān)于抗原試劑的原理和適用方法

作者:  時(shí)間:5/18/2022 11:49:09 AM
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新型冠狀病毒的檢測在過(guò)去一段時(shí)間內成為了被大家所關(guān)心的話(huà)題。一方面,早在1月上旬,科學(xué)家們對新型冠狀病毒完成測序之后就有好幾家企業(yè)加班加點(diǎn)兩三天內完成了“核酸檢測試劑盒”,并且產(chǎn)能看起來(lái)頗為足夠。但另一方面,即使中旬后放開(kāi)了檢測標準,不需要通過(guò)國家疾控中心才能確診,仍然有大量患者無(wú)法得到確診。這其中的檢測卡口以及使用試劑盒檢測的難點(diǎn)到底在哪呢?


乍聽(tīng)起來(lái),試劑盒好像是類(lèi)似于化學(xué)課上酸堿試紙那樣的東西,滴一滴就會(huì )變色??蓪?shí)際上它的用法與最初的想象大不相同,復雜多了。


確診由病毒引起的疾病有幾種方式。從大類(lèi)上分,可以直接檢測病毒的核酸,或者檢測病毒中會(huì )讓人產(chǎn)生免疫反應的抗原,或是檢測人體免疫反應所產(chǎn)生的抗體。由于科學(xué)家迅速對病毒完成了測序,因此這次最早完成設計生產(chǎn)的試劑盒也是屬于檢測核酸的類(lèi)別。它使用的方法叫做PCR(聚合酶鏈式反應),能夠快速對微量DNA進(jìn)行檢測,并且相當靈敏。除了生物領(lǐng)域以外,它在法醫和考古等領(lǐng)域也有著(zhù)重要的應用。


檢測冠狀病毒的時(shí)候會(huì )采取病人的鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等作為樣本——換言之就是可能包含有病毒的東西。之后,需要用試劑提取出其中的核酸部分。由于冠狀病毒的遺傳物質(zhì)是單鏈的RNA,因此還需要使用逆轉錄酶將RNA逆轉錄為DNA。


回顧一下中學(xué)生物有關(guān)DNA的內容:DNA是生物體內記錄信息的物質(zhì),呈雙鏈結構。每條鏈都由一系列核苷酸組成。每個(gè)核苷酸會(huì )攜帶四種堿基之一:A,T,C和G。兩條鏈之間按A-T和C-G的堿基互補規則匹配。

檢測病毒時(shí),樣本內不只有病毒的核酸,還有人體細胞以及其他各種正常存在的細菌、病毒的核酸。打個(gè)比方的話(huà),就好像是要求從一個(gè)雜亂無(wú)章的圖書(shū)倉庫里找出有沒(méi)有西游記一樣。PCR的想法就是對需要的DNA片段進(jìn)行復制。如果有一種專(zhuān)門(mén)負責抄寫(xiě)西游記的小妖怪,一本抄兩本,兩本抄四本,那只要倉庫里有一本西游記,很快就能讓倉庫里出現大量的西游記,到時(shí)候再檢測就容易多了。


這種小妖怪聽(tīng)起來(lái)很神奇,實(shí)際上模擬的正是我們體內每天都在進(jìn)行的DNA復制。PCR首先會(huì )用高溫讓DNA變成單鏈,然后利用兩種物質(zhì)進(jìn)行DNA復制過(guò)程:一種叫“引物”,是一小串核苷酸鏈,能自動(dòng)結合到能夠匹配的DNA片段上??梢园阉胂癯梢粋€(gè)神奇書(shū)簽。預先往書(shū)簽上寫(xiě)好幾個(gè)字,它就可以自動(dòng)找出倉庫里寫(xiě)有這幾個(gè)字的書(shū)頁(yè)粘上去。另一種叫“聚合酶”,會(huì )從引物開(kāi)始,為單鏈DNA補齊另外一條。它相當于一個(gè)抄書(shū)匠,會(huì )從神奇書(shū)簽開(kāi)始抄書(shū)。這樣就產(chǎn)生了“擴增”“特定”DNA片段的效果。設計病毒的核酸檢測試劑盒的過(guò)程主要是根據病毒的測序結果選擇其中的幾個(gè)有特征的基因,并在每個(gè)基因靠近頭尾的地方選取兩串引物。為了保證實(shí)驗效果,對引物還有一些額外的要求,比如活性溫度必須適當,引物之間不能結合等等。


除了復制以外,還需要檢測擴增過(guò)程是否順利。目前的試劑盒采用的是熒光探針?lè )?。熒光探針是帶有兩個(gè)額外基團的小串核苷酸鏈,其中一個(gè)能放出熒光。但是,探針完整時(shí)熒光會(huì )被另一個(gè)基團吸收。在DNA復制過(guò)程中,聚合酶會(huì )將熒光探針?lè )纸?,產(chǎn)生熒光。這就像是一個(gè)有著(zhù)熒光膜的神奇書(shū)簽。抄書(shū)匠在抄書(shū)過(guò)程中一旦發(fā)現就會(huì )撕掉。DNA每擴增一次理論上就會(huì )多一倍熒光分子,這樣就可以根據熒光的強度看出DNA擴增的次數。如果原始樣品里有目標片段,熒光的強度就會(huì )隨著(zhù)擴增次數指數增長(cháng)。如果沒(méi)有目標片段,就不會(huì )產(chǎn)生新的熒光分子。


這整套測試過(guò)程需要實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統來(lái)完成,它有著(zhù)溫度控制和實(shí)時(shí)檢測熒光強度的功能。分解DNA成單鏈、引物結合和聚合酶工作的反應溫度均不相同,儀器需要以固定的時(shí)間間隔在兩個(gè)溫度間循環(huán)(后兩者所需溫度差不超過(guò)3攝氏度時(shí)可以用一個(gè)溫度)。檢測熒光強度則需要包含光源和探測器的裝置。光源能夠精密地照射到每一個(gè)樣品上,然后由探測器檢測熒光的強度。隨著(zhù)擴增循環(huán),熒光強度就會(huì )畫(huà)出一條曲線(xiàn),用以判斷目標DNA片段是否存在。按照目前新聞的報道,PCR每批測試時(shí)間需要2-4個(gè)小時(shí),普通PCR儀一次可以對96個(gè)樣本進(jìn)行測試,高級的PCR儀可以一次做384個(gè)樣本,武漢市內十個(gè)實(shí)驗室每天總共可以檢測2000多例。(到文章發(fā)布為止,湖北省內據說(shuō)每天可以檢測4000多例)


除此之外,由于PCR技術(shù)異常靈敏,因此需要專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗室和人員進(jìn)行操作。在基本的實(shí)驗室布置中,儲藏試劑、準備樣品和進(jìn)行PCR需要在三個(gè)不同的房間進(jìn)行,并且還需要PCR室保持負壓潔凈狀態(tài),即PCR室的空氣不會(huì )流入其他房間,這樣才可以保證樣品不會(huì )受到擴增后的DNA產(chǎn)物污染。而如果針對病毒處理的話(huà),還要求實(shí)驗室需要具備相應的病毒防護資質(zhì)才可以(當然不需要P4級別那么高)。整套下來(lái)并非所有醫院都能輕松配備。


而針對病人,一個(gè)病人在病程中可能需要經(jīng)歷至少三次測試:一次確診(結果陽(yáng)性,視病程不同也可能因為假陰性而重復幾次)與判斷治愈需要的兩次測試(要求結果陰性),而目前每天新增的疑似病人也超過(guò)了湖北省內的處理能力。所以雖然生產(chǎn)試劑盒的數量遠遠大于疑似人數,但實(shí)際做測試的數目還是非常有限的。


PS:抗原試劑需要在GMP凈化車(chē)間進(jìn)行灌裝封口、全自動(dòng)灌裝無(wú)人工接觸才符合生產(chǎn)要求,避免二次污染


PS:廣東冠鴻智能的試劑灌裝機精度高、產(chǎn)量穩定15000支/小時(shí) 值得推薦

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